Ingeniería genética

    El término de ingeniería genética engloba diversas técnicas que permiten la modificación programada de seres vivos o, lo que es lo mismo, cambiar el genoma de cualquier individuo de una manera selectiva. Este conjunto de técnicas –a las que se las denomina, indistintamente, técnicas de clonación, del ADN recombinante o de manipulación genética– permiten manipular el ADN de prácticamente cualquier organismo, clonándolo, mutándolo en puntos concretos, analizando su secuencia, transfiriéndolo a otras células u organismos para que se exprese, etc.

    Para llevar a cabo todos los procesos que engloba la ingeniería genética, se dispone de una serie de elementos y de técnicas que los hacen posible: las enzimas de restricción, los vectores, la transferencia génica, la reacción en cadena de la polimerasa (abreviado en inglés, PCR) o la secuenciación.

    Este conjunto de metodologías constituye una importantísima herramienta para poder llevar a cabo investigaciones sobre la función y expresión de los genes de un organismo, permitiendo, además, la obtención de productos de interés farmacológico o médico, la mejora de animales y plantas, que presentan ciertas ventajas frente a otros no modificados, así como el desarrollo de una nueva estrategia en el tratamiento y curación de enfermedades, la denominada terapia génica. Teniendo esto en cuenta, la ingeniería genética ha supuesto una auténtica revolución a muchos niveles: en la ganadería, en la agricultura, en la medicina y en la microbiología industrial.

    Enzimas de restricción

    El desarrollo de la ingeniería genética comenzó en la década de 1970 gracias al descubrimiento de ciertas proteínas de carácter enzimático, las denominadas enzimas de restricción, que suponen la pieza clave en las técnicas del ADN recombinante. En general, este tipo de enzimas se llaman nucleasas, ya que son capaces de degradar los ácidos nucleicos, bien en su forma ADN, bien como ARN. Dentro de las nucleasas puede haber dos tipos de enzimas: las exonucleasas, que degradan en material genético desde los extremos de la cadena (exo-, «fuera»); o las endonucleasas, que son capaces de degradar los ácidos nucleicos dentro de la cadena (endo-, «interior, dentro»), y a las que pertenecen las enzimas de restricción. Para realizar esta acción, estas enzimas deben reconocer secuencias específicas en el ADN, es decir, ejercer su acción en aquellos puntos del ácido nucleico que presenten una secuencia de nucleótidos concreta («secuencia diana») que puede ser «leída» por esa enzima.

    Existen varios tipos de enzimas de restricción, denominados tipo I, II y III, cada uno de los cuales presenta distintas características. Las enzimas de tipo I, las primeras en poder aislarse y estudiarse, reconocen su secuencia diana y «cortan» o degradan el ADN a cierta distancia siguiendo un mecanismo de actuación muy complejo. Las de tipo III, las últimas en descubrirse, son relativamente raras y no se utilizan apenas. Las verdaderas piezas fundamentales en la ingeniería genética son las enzimas de tipo II, las cuales actúan degradando en el mismo lugar en el que reconocen su secuencia diana; ésta está formada por una secuencia de nucleótidos capicúa: si se leen los nucleótidos en sentido 5’ 3’, la secuencia es la misma que si se leen en la hebra complementaria, en sentido 3’ 5’. Este tipo de enzimas pueden realizar dos tipos de cortes: cortes quebrados, produciendo extremos terminales cohesivos, es decir, que «encajan»; o cortes lisos, creando extremos romos. En la figura 1 se muestra el mecanismo de actuación de las enzimas de tipo II.

    Se han podido identificar hasta 150 tipos de enzimas de restricción de tipo II, que se nombran siguiendo ciertas reglas: la primera de las letras procede del género del microorganismo del que originalmente se aisló la enzima; a continuación se consigna la especie con las dos letras siguientes; la cuarta procede de la cepa. Si hay más de un sistema de enzimas en el microorganismo, las enzimas se enumeran con números romanos. Así, por ejemplo, en la enzima EcoRI, la «E» hace alusión al género Escherichia, «co» se refiere a la especie coli, y «R» a la cepa RY13; dado que existen más sistemas de enzimas que proceden de dicho microorganismo, en este caso la abreviatura EcoR debe adoptar la numeración romana, dando lugar a EcoRI. Otros ejemplos de enzimas de tipo II son BamHI, PstI o HindII.

    Debido a sus características de funcionamiento, las enzimas de restricción presentan numerosas aplicaciones directas dentro de la biología molecular, como la fragmentación de genomas o el diagnóstico de enfermedades. Sin embargo, existen otras muchas aplicaciones en las que el uso de estas proteínas se combina con otro tipo de técnicas, como ocurre en la metodología de la clonación de los genes o los genomas, dentro de la ingeniería genética.

    Vectores

    Como se ha comentado anteriormente, las enzimas de restricción tienen la capacidad de reconocer diversas secuencias de nucleótidos, fragmentando el ADN por ese punto. Gracias a ello se crean extremos que pueden ser unidos a otros, incluso si son de organismos muy dispares; éstos serán complementarios siempre que hayan sido cortados por la misma enzima. Esta propiedad es aprovechada en la ingeniería genética para poder obtener construcciones genéticas que actúan como «vehículos» para la introducción de ADN extraño en células huéspedes; a dichas construcciones genéticas se las denominan vectores.

    Mecanismo de actuación de una de las enzimas de restricción más conocidas, el EcoRI.

    Existen numerosos elementos que pueden ser utilizados como vectores, entre los que destacan los plásmidos, los bacteriófagos o los cromosomas artificiales de bacterias, todos ellos de origen procariota. Hay, además, otros tipos de vectores: los de levaduras y los virales, más complejos que los procariotas. Todas estas construcciones se pueden, a su vez, clasificar en dos grandes grupos según sea su función. Por un lado están los vectores de clonaje, que se utilizan para producir numerosas copias del fragmento de ADN que lleva insertado; por otro lado, están los denominados vectores de expresión, de estructura más compleja, con los que se quiere conseguir la expresión del gen exógeno o foráneo (síntesis de la proteína que codifica ese gen).

    Plásmidos. Son moléculas circulares presentes en bacterias, formadas por material genético extracromosómico (independiente al material genético que forma el cromosoma), que se replican de manera autónoma al cromosoma bacteriano, aunque utilizando las enzimas que posee la bacteria. Estos elementos independientes, con algunas modificaciones en su estructura, son utilizados como vectores, es decir, como «medios de transporte» para poder introducir fragmentos de ADN externo en bacterias y obtener así elevadas cantidades de este ADN (clonaje del ADN). Los plásmidos que son utilizados como vectores poseen una serie de características comunes:

    • tienen un tamaño pequeño para poder manejarlos mejor;

    • carecen de los genes que les permiten moverse de una bacteria a otra;

    • tienen sitios de multiclonaje formados por varias secuencias diana que pueden ser reconocidas por distintas enzimas de restricción (será ahí donde se inserten el gen o los genes que se quieren clonar);

    • presentan uno o varios genes de selección que confieren resistencia a ciertos antibióticos, permitiendo la selección de las bacterias que han introducido el vector en su interior (las bacterias que no poseen el vector y, por tanto, los genes de resistencia al antibiótico morirán);

    • por último, tienen un origen de replicación independiente del cromosoma bacteriano, por lo que la replicación del plásmido se produce de manera totalmente autónoma a como lo hace el cromosoma.

    En la figura 2 se muestra cómo se inserta un fragmento de ADN extraño a un plásmido que actúa como vector.

    Uso de un plásmido circular para la clonación de un fragmento de ADN humano y su posterior replicación.

    Bacteriófagos (o fagos). Los bacteriófagos, comúnmente denominados fagos, son parásitos muy sencillos de bacterias, a las que necesitan para llevar a cabo su replicación. Este proceso se puede llevar de dos maneras: una de ellas, denominada ciclo lítico, convierte a la bacteria en una «máquina» de producir bacteriófagos, provocando su muerte; en la otra, denominada ciclo lisogénico, los fagos integran su material genético en el genoma de la bacteria, replicándose a la vez que lo hace éste pero sin provocar la muerte de la bacteria. Esta última alternativa es aprovechada en la ingeniería genética para llevar a cabo el clonaje de un determinado fragmento de ADN: el gen exógeno que se quiere clonar se inserta en el material genético del fago, que se modifica para convertirlo en un vector adecuado; éste se integrará a su vez en el cromosoma bacteriano al producirse la infección y, posteriormente, cuando la bacteria replique su cromosoma, se producirán multitud de copias del gen de interés. Este sistema presenta ciertas ventajas, como por ejemplo, el poder introducir grandes cantidades de ADN exógeno, ya que el material genético del fago tiene muchos genes que se pueden eliminar sin modificar sus funciones, dejando espacio libre para insertar fragmentos de ADN de gran tamaño.

    Vectores de levaduras. Las levaduras son organismos unicelulares eucariotas que se utilizan en ingeniería genética tanto para el clonaje de fragmentos de ADN, como para la expresión de genes foráneos. Existen varios tipos de vectores que derivan de estructuras presentes en levaduras, entre los que destacan los cromosomas artificiales y los vectores basados en el círculo de 2 µm.

    Los cromosomas artificiales son vectores de origen procariota a los que se les ha añadido elementos de levaduras, y que se utilizan fundamentalmente para el clonaje de ADN. Presentan la ventaja de no necesitar integrarse en el genoma de la levadura para poder replicarse, ya que poseen un origen de replicación autónomo, y de ser capaces de clonar fragmentos muy grandes de ADN (son, de entre todos los vectores, los que mayor capacidad tienen).

    Los vectores basados en el círculo de 2 µm son construcciones derivadas del plásmido de 2 µm de la levadura Saccharomyces cerevisae (levadura de la cerveza), al que se le añade un origen de replicación y un gen de resistencia a antibiótico. Este tipo de vectores se utilizan fundamentalmente para producir la expresión del gen insertado, como sistema para realizar investigación, tanto básica como aplicada.

    Recombinación de ADN por medio de un clon cósmico (plásmido artificial derivado del bacteriófago λ).

    Vectores virales. Este tipo de vectores se construyen a partir del genoma de un virus, y son utilizados para insertar ADN exógeno en células de animales mamíferos para su expresión, aprovechando la capacidad de estos microorganismos de infectar este tipo de células, a las que transfieren sus genes. Sin embargo, existen grandes limitaciones en el uso de estos vectores, debido a que estas construcciones pueden ser patogénicas (pueden producir enfermedades) en la mayoría de los casos. Casi todos los virus pueden ser utilizados como vectores, manipulándolos siempre para reducir al máximo su patogenicidad, aunque los más empleados son los retrovirus, los adenovirus, los adenoasociados y los herpesvirus.

    Los retrovirus son virus que poseen una molécula de ARN como material genómico, y son capaces de provocar infecciones en muchas especies animales diferentes; el vih, responsable del sida en el ser humano, es un tipo de retrovirus. Los vectores que se fabrican a partir del genoma de estos virus no llevan, sin embargo, los genes virales que provocan la enfermedad, ya que en su lugar se coloca el gen o los genes exógenos que se quieren expresar. El retrovirus modificado inserta la molécula de ARN en el genoma de la célula infectada, integrándose en él al 100 %, lo que asegurará su expresión celular en el mamífero. En cualquier caso, los retrovirus presentan numerosos inconvenientes de consecuencias muy graves, entre los que destacan la posibilidad de producir diversas enfermedades, entre ellas, cáncer.

    Por otro lado, los adenovirus parecen más ventajosos, ya que presentan baja patogenicidad, provocando, como mucho, simples resfriados. Al igual que en los retrovirus, para la construcción de los vectores se eliminan los genes que producen la enfermedad y en su lugar se inserta el gen de interés. Sus desventajas son que solo infectan bien células epiteliales (células de la piel y de cavidades internas del cuerpo), que pueden provocar una fuerte respuesta inmunológica por parte del organismo (anulando la expresión del gen de interés), y que sólo aceptan fragmentos de ADN de un tamaño limitado.

    Los adenoasociados, por su parte, son virus que necesitan un virus «ayudante» (un adenovirus) para poder producir la infección de una célula. Entre sus ventajas destacan que son virus no patogénicos, infectan a casi todas las células y siempre se insertan en el genoma celular en un mismo punto. Las desventajas que presentan son que los vectores no permiten insertos de gran tamaño y que provocan una respuesta inmunológica cuando infectan células del cuerpo humano.

    Uso de un retrovirus para terapia génica. Antes de ser empleado como vector, se debe eliminar casi todo el genoma del retrovirus para impedir su replicación e infección.

    Los herpesvirus, por último, son virus que infectan principalmente neuronas, por lo que se consideran los mejores vectores para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, como por ejemplo, la esclerosis múltiple. Este tipo de vectores son de gran tamaño, por lo que se hace complicado su manejo en el laboratorio pero son los vectores que presentan la mayor capacidad de inserto de ADN foráneo.

    Transferencia génica

    La transferencia génica es el proceso por el que un fragmento de ADN foráneo, que es «transportado» en vectores, se introduce o bien en células que se encuentran en cultivo, o bien en organismos enteros (animales o plantas). Existen dos estrategias de transferencia génica según el tipo de vectores que se utilicen: la transfección génica y la transducción génica.

    Transfección génica

    Mediante el proceso de transfección génica se transfieren genes a células por cualquier método físico, químico o mecánico, exceptuando la utilización de vectores virales (transducción génica). También se llama transformación, pero este término apenas se utiliza puesto que se puede confundir con el mecanismo por el que una célula sana se convierte en maligna en un proceso canceroso. Este tipo de técnica génica se suele utilizar para introducir genes externos en células en cultivo y presenta grandes ventajas, ya que los métodos físico-químicos empleados resultan menos agresivos para la célula que el uso de vectores virales. Sin embargo, la transferencia es poco eficiente ya que sólo en un 10-40 % de los casos se logra introducir el vector que lleva el gen de interés.

    Método mecánico. En este método se utiliza una micropipeta (muy similar a la aguja de una jeringuilla) con la que se realiza una microinyección en la célula, introduciendo en su citoplasma una solución que contiene los vectores que llevan el gen de interés insertado. La eficiencia de este método es del 100 %, pero presenta la desventaja de que es un proceso muy lento ya que las células se tienen que manipular de una en una, y de manera muy cuidadosa.

    Método eléctrico. También llamado electroporación, se utiliza mucho en bacterias. El proceso se realiza incubando las células que se quieren modificar con grandes cantidades del plásmido que lleva el gen de interés. Esta mezcla es sometida a descargas eléctricas que provocan la formación de pequeños poros en la membrana plasmática de las células, permitiendo el paso de los plásmidos a su interior. Es un método muy eficiente pero a la vez muy agresivo, por lo que hay que poner un especial interés en ajustar la intensidad de las descargas para no dañar las células.

    Métodos químicos. El fundamento de este tipo de métodos consiste en la incubación del ADN que se quiere insertar con una molécula, con lo que se consigue la formación de un complejo que es capaz de entrar en la célula. Las moléculas pueden ser de diversa naturaleza lo que a su vez implica la diferenciación de métodos.

    Por un lado, se pueden utilizar precipitados de fosfato cálcico, que inducen a la célula a «ingerir» el ADN por endocitosis, aunque no se conoce muy bien el mecanismo. Cualquier tipo de célula puede ser transfectada mediante este sistema, aunque la eficiencia resulta muy baja. Otro tipo de moléculas utilizadas son los lípidos, los cuales forman estructuras muy complejas con el ADN que permiten su entrada en las células. Con esta metodología se consiguen eficiencias de hasta un 80 %. Para aumentar este porcentaje se emplean otro tipo de moléculas, los policationes (por ejemplo, el llamado polibreno-DMSO), que es capaz de «arropar» y cubrir el ADN, favoreciendo su adsorción en la membrana plasmática. En levaduras, la transfección se realiza mediante un tratamiento de las células con sales de litio y un choque térmico para facilitar la entrada del ADN.

    Transducción génica

    Este proceso aprovecha un mecanismo natural y seleccionado en la evolución para transferir genes: la infección de las células por agentes virales. La transducción tiene lugar cuando un virus se pega a la membrana plasmática de una célula, desestabilizándola y permitiendo la internalización del microorganismo hacia el interior de la célula. Una vez dentro, el virus se despoja de su envoltura externa y libera su ácido nucleico en el citoplasma. A partir de este punto, el genoma viral puede seguir dos caminos alternativos: o bien quedarse como una molécula extracromosómica, o bien viajar hasta el núcleo e integrarse en el material genético de la célula. Esta última opción es aprovechada por la ingeniería genética para conseguir la integración del fragmento de ADN de interés y conseguir así su expresión.

    Proceso de PCR en el que se somete al ADN a diversos ciclos de calor y frío para provocar sucesivamente su desnaturalización, anillamiento con un cebador y su extensión. La repetición de posciclos puede dar lugar a numerosos fragmentos de ADN unidos al cebador.

    El proceso de transducción es muy eficiente pero al ser llevado a cabo por virus, siempre existe el riesgo de patogenicidad, o de provocar una respuesta inmune por parte del organismo que anule la expresión del gen insertado, etc.

    Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

    Es éste un método alternativo al clonaje con el que se pueden obtener, de una manera «artificial», multitud de copias de ADN a partir de cantidades casi ínfimas de ácido nucleico sin necesidad de utilizar ningún tipo de organismo. Se trata de un procedimiento enzimático que necesita, como principal requisito, el conocimiento de las secuencias que flanquean el fragmento de ADN que se quiere amplificar, llamado ADN molde. A partir de estas secuencias conocidas, se sintetizan unos pequeños oligonucleótidos, cuyas secuencias serán complementarias a las que se encuentran en los extremos del ADN molde (cebadores). Son necesarios también para el proceso una enzima capaz de sintetizar una cadena de ADN a partir de otra, es decir, una polimerasa, y un aparato que permite producir ciclos de diferentes temperaturas (termociclador).

    La metodología de la PCR es muy sencilla. En primer lugar, se introduce en un pequeño tubo una mezcla que contiene el fragmento de ADN que se quiere amplificar (ADN molde); unos cebadores que son complementarios a los extremos de ese ADN; la enzima polimerasa, que es resistente a los cambios de temperatura, obtenida de la bacteria Thermus aquaticus (Taq) denominada Taq polimerasa; y gran número de nucleótidos, los cuales se irán añadiendo a las cadenas que se sintetizan. A continuación, esta mezcla se introduce en el termociclador, donde experimentará una serie de ciclos. Cada ciclo de PCR comienza con la desnaturalización a 95 °C de la doble cadena del ADN molde (las dos hebras se separan); a continuación, se baja la temperatura a 55 °C, provocando la unión de los cebadores con sus respectivas secuencias complementarias de la cadena molde; posteriormente, la temperatura vuelve a subir, esta vez a 72 °C, produciéndose la extensión de las hebras complementarias a las cadenas molde gracias a la polimerasa, que añade nucleótidos a partir de los cebadores. La sucesión de varios ciclos de este tipo provoca que se formen fragmentos copia del ADN molde de manera exponencial. En la figura 5 se muestra cómo se desarrolla el proceso de PCR.