Aplicaciones de la ingeniería genética. Clonación y genomas

La ingeniería genética permite la manipulación del ADN, con lo que se consigue, entre otras cosas, la obtención de copias idénticas de un fragmento concreto de ácido nucleico o de individuos enteros (clonación), la mutación de determinados puntos o secuencias de genes (mutagénesis dirigida), o el estudio de la secuencia de nucleótidos de genomas enteros o de parte de ellos (secuenciación). El método de clonación permite, además, utilizar células como fábricas para la obtención de ciertas proteínas de gran interés comercial, como por ejemplo, la insulina. Con la secuenciación se ha conseguido asimismo descifrar cómo están «escritas» las instrucciones que definen a cada organismo, es decir, su genoma. Entre los genomas secuenciados destaca, especialmente, el humano, abriéndose el camino a multitud de posibilidades terapéuticas. Además, ha servido para averiguar, por ejemplo, que los hombres y los chimpancés tienen en común el 98% de sus secuencias génicas, o que el tamaño del genoma de una simple cebolla es cinco veces mayor que el del genoma de la especie humana, aunque esto no signifique que la cebolla sea de mayor complejidad que un humano.

Clonación

La clonación es el proceso por el que se obtienen copias idénticas, bien de un fragmento de ADN, bien de un organismo entero. En el caso del clonación de un fragmento de ADN, la metodología que se sigue consta de varios pasos: selección del fragmento de ADN que se quiere clonar, inserción de este fragmento en un vector, introducción de la construcción (gen de interés y plásmido) en un huésped en el que se pueda replicar y selección de los organismos que han insertado el vector. El proceso de clonación de organismos enteros es mucho más complejo que el caso anterior, ya que se requiere un traspaso de material genético de un tipo de células a otras, con el consiguiente problema de rechazo.

Clonación de genes

El proceso de clonación de genes permite obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN concreto. Actualmente, mediante el uso de esta técnica es posible aislar un gen determinado de cualquier genoma en concentraciones suficientes como para llevar a cabo su caracterización (determinar su secuencia, su función, su regulación, etc.), metodología que, antes del desarrollo de la ingeniería genética, era prácticamente impensable. Además de esta aplicación de carácter analítico, indispensable en investigación básica y aplicada, el proceso de clonación tiene una aplicación farmacológica o biomédica, ya que permite, aprovechando la producción de numerosas copias de un fragmento de ADN, la obtención masiva de proteínas de interés, llamadas proteínas recombinantes, como puede ser la insulina.

La clonación de genes se puede llevar a cabo bien en bacterias, microorganismos procariotas muy sencillos, bien en levaduras, organismos unicelulares de origen eucariota. Ambos tipos de células presentan ciertas características que se convierten en ventajas a la hora de realizar experimentos de clonación: son unicelulares, por lo que permiten una fácil manipulación, y tienen un crecimiento rápido. Las levaduras, además, presentan una ventaja adicional y es que, al ser organismos eucariotas, tienen la capacidad de realizar procesos de expresión de genes y modificaciones de proteínas que se llevan a cabo en organismos eucariotas superiores (animales y plantas), función indispensable para la «fabricación» de ciertas proteínas de interés.

Cromosoma artificial de la levadura (YAC en sus siglas inglesas). Hospedado en levaduras, se utiliza en ingeniería genética gracias a su rápido crecimiento y a que lleva a cabo procesos de expresión de genes y modificaciones de proteínas.

La estrategia que se sigue para la realización de un proceso de clonación es muy similar, tanto si se quieren obtener multitud de copias de fragmentos de ADN como de proteínas recombinantes. En primer lugar, hay que seleccionar el gen de interés del genoma en el que se encuentre y someterlo a un proceso de corte con una determinada enzima de restricción. La misma enzima se utiliza para cortar el elemento que vaya a ser utilizado como vector (normalmente, un plásmido), creándose dos extremos que van a ser complementarios a los extremos producidos en el fragmento de ADN. De esta manera, se permite la unión de ambos elementos, creándose un vector de ADN recombinante, ya que posee una mezcla de ADN proveniente del elemento que actúa como vector y ADN de interés.

Los vectores utilizados en clonación están construidos de diferente manera dependiendo de si van destinados a la simple copia del ADN de interés o, además, se pretende la expresión de ese gen, denominándose vectores de expresión. En el primer caso, los vectores son más sencillos y requieren unos elementos mínimos: un origen de replicación en bacterias o en levaduras, que es el punto en el que comienza la replicación del vector; un sitio de policlonación, zona que presenta multitud de secuencias específicas para enzimas de restricción y en la que se inserta el gen de interés; y uno o varios genes de resistencia a antibióticos para la selección de las bacterias o las levaduras que han introducido el vector recombinante. En el caso de los vectores de expresión, además de los enumerados anteriormente, son necesarios otro tipo de elementos, que permiten la regulación de la expresión del gen insertado.

Una vez que se tiene el vector construido, el paso siguiente es su introducción en las bacterias o en las levaduras. Para ello, se puede llevar a cabo cualquiera de los métodos de transferencia génica (transfección o transducción). Como las técnicas de transferencia génica no son eficaces al 100 %, en la mayoría de los casos habrá cierta cantidad de células que no han introducido en su interior el vector que lleva el gen de interés. Para averiguar cuáles son estas células, las bacterias o las levaduras son sometidas a un tratamiento con uno o varios antibióticos (los mismos para los que el gen o los genes del vector ofrecen resistencia). Como consecuencia, las células que no han introducido el vector recombinante no van a poseer la resistencia a ese antibiótico o antibióticos y, por tanto, morirán. En cambio, las que sí hayan incorporado el vector, poseerán la resistencia a los antibióticos del tratamiento de selección y sobrevivirán.

Una vez dentro de las bacterias o de las levaduras, el vector puede seguir dos vías distintas: por un lado, puede permanecer como un elemento extracromosómico, es decir, sin integrarse en el genoma de la célula o, por otro lado, puede insertarse (más concretamente, el gen de interés) en el genoma celular. Para el proceso de clonación de un fragmento de ADN, el vector no necesita insertarse en el genoma, ya que se replicará de manera independiente (ya que tiene un origen de replicación independiente al del cromosoma de la célula), produciéndose multitud de copias del gen de interés (clonación de un fragmento de ADN). Por el contrario, si lo que se quiere es la producción masiva de proteínas recombinantes, el vector tiene la «obligación» de integrar el gen de interés en el ADN de la célula en la que se encuentre para que, de esta manera, se lleve a cabo su expresión gracias a mecanismos de la célula (transcripción, traducción, etc.), como si fuera un gen más.

Mediante el proceso de clonación se han podido producir, a gran escala, proteínas de gran interés farmacológico y biomédico. Un importante ejemplo de proteína recombinante es la insulina, hormona que regula la cantidad de azúcar en sangre, y que se ha sintetizado con éxito en la bacteria Escherichia coli. Otras proteínas sintetizadas a partir de ADN recombinante son la enzima alcohol oxidasa o la albúmina de suero humano (obtenidas en levaduras), el factor VIII de coagulación humano (en bacterias), moléculas de anticuerpo (también en bacterias), etc.

Clonación de organismos

El proceso de clonación no sólo es aplicable a fragmentos de ADN, sino que también puede ser utilizado para la obtención de un organismo genéticamente idéntico a otro, es decir, clónico. La metodología es bastante compleja, siendo muy difícil obtener unos buenos resultados. Este tipo de clonación, también denominada transferencia nuclear o transferencia de núcleos diploides, consiste, básicamente, en extraer el material genético de una célula sexual femenina de un organismo determinado e introducir, en esa célula «vacía», un nuevo ADN procedente de otro organismo.

La oveja Dolly, en la imagen, obtenida mediante clonación en 1997 tras un laborioso proceso.

Aunque se han desarrollado diferentes procedimientos según la especie de la que se trate, el proceso de clonación sigue unas pautas comunes. En primer lugar, se extrae el material genético de un oocito (u ovocito, célula sexual femenina que se encuentra en los ovarios y que se transforma en óvulo durante el período de la ovulación), y se sustituye por el material genético diploide procedente de las células de otro organismo adulto de la misma especie. El oocito así manipulado es sometido a un choque eléctrico para que comience a desarrollarse como un embrión normal que se implanta en una hembra, que actúa como «madre de alquiler». El individuo que nazca a partir de ese cigoto será genéticamente idéntico a aquel organismo adulto que le «donó» el material genético diploide.

El primer experimento de este tipo se llevó a cabo en ranas, pasándose a continuación a la experimentación en mamíferos. En este último caso, el procedimiento se ha llevado a cabo en diferentes tipos de organismos, como por ejemplo, ratones, ovejas, primates o cerdos, obteniéndose diferentes tasas de éxito para cada uno de ellos. En general, las eficiencias no son muy altas, ya que se produce una elevada tasa de anomalías fetales y muerte de embriones, por lo que el individuo clonado no llega nunca a nacer.

A pesar de estos inconvenientes, en 1997, un equipo de científicos de Edimburgo consiguió «fabricar» una oveja clónica, Dolly, a partir de la metodología descrita. Para conseguirlo, llevaron a cabo un procedimiento bastante laborioso, ya que se utilizaron 434 oocitos, pero sólo se pudo introducir el material genético de una oveja adulta en 277 de ellos. De éstos, solamente 29 consiguieron seguir adelante como embriones, implantándose en ovejas hembras, de las que sólo 13 resultaron preñadas. Finalmente, sólo una de estas 13 ovejas consiguió parir una cría.

En el caso, por ejemplo, de humanos, se ha realizado un cálculo de lo que se necesitaría para poder obtener con éxito un individuo clónico: se requerirían unos 400 oocitos, procedentes de más de 40 donantes, a las que se las sometería a un tratamiento de fertilización para provocar una mayor ovulación. A todos estos oocitos se les extraería el material genético y se fusionaría con el material genético de células procedentes de un individuo adulto. Para implantar todos estos embriones se necesitarían, al menos, 50 madres portadoras; solamente en nueve o diez de ellas se produciría un embarazo. De éstos, sólo uno de ellos llegaría a buen término, del que nacería un bebé sano clónico; en el resto se producirían abortos o el nacimiento de fetos con anomalías. Obviamente, esta metodología aún no se ha llevado a cabo, sobre todo por los problemas éticos que plantea.

Estudio del genoma

Otra de las principales aplicaciones que ofrece la ingeniería genética es la posibilidad de analizar con detalle la secuencia de los nucleótidos que forman los genomas de todos los organismos (secuenciación del genoma). Ya que la variabilidad de una molécula de ADN radica en el orden en el que se encuentran sus cuatro nucleótidos (una pequeña diferencia en la secuencia de A, T, C y G de dos moléculas de ADN puede producir grandes cambios en sus productos), esta metodología permite hallar cuál es el orden exacto, permitiendo establecer las diferencias y similitudes entre dos moléculas de ADN. La secuenciación supone una herramienta fundamental para el estudio de los genomas: por ejemplo, la comparación de los mapas genéticos de individuos de la misma especie permite establecer la existencia o no de pequeñas diferencias que podrían ser la causa de enfermedades, lo que supondría un valioso instrumento para su diagnóstico precoz; por otro lado, la comparación de las secuencias del genoma de diferentes especies, por ejemplo una cebolla con el ser humano, ofrece una visión más detallada del proceso de evolución, estableciéndose cómo pueden ser de iguales o diferentes las especies.

Técnicas de secuenciación

Existen dos métodos de secuenciación: el método químico, descrito por Maxam y Gilbert; y el método enzimático, que fue descrito por Sanger. Ambas técnicas presentan algunas similitudes, como por ejemplo, la necesidad de generar fragmentos de ADN de hebra simple, o de marcar dichos fragmentos con moléculas radiactivas para su posterior identificación.

Método químico. Este método comienza con el marcaje radiactivo con 32P (fósforo 32) de los dos extremos 5’ de un fragmento de ADN cuya secuencia se quiere determinar (el ADN, al ser una doble hebra, tiene dos extremos 5’). Muchos fragmentos así marcados son sometidos al tratamiento con una enzima de restricción, que cortará en un sitio específico, generando fragmentos más pequeños de ADN del mismo tamaño; se tienen, por tanto, multitud de moléculas idénticas, todas ellas marcadas en el mismo extremo. A continuación, estos fragmentos se someten a cuatro tipos diferentes de reacciones químicas, cada una de ellas específica para el corte del ADN por un nucleótido en concreto: se emplea ácido fórmico para el corte en los sitios en los que haya una adenina o una guanina, formato amónico para el corte específico por guaninas, permanganato potásico (KmnO4) para el corte por el sitio en el que haya timinas, e hidroxilamina para cortar por el lugar donde se encuentren citosinas.

Estas reacciones se controlan de tal manera que sólo produzcan un corte en cada fragmento, obteniéndose así subfragmentos que tienen una marca radiactiva en uno de sus extremos y el punto de escisión química en el otro. Estos fragmentos de ADN son sometidos a una técnica de separación (electroforesis en gel) que tiene la capacidad de separar, en una especie de plancha de gelatina, los fragmentos obtenidos en las reacciones químicas por sus tamaños; éstos se pueden visualizar sometiendo al gel resultante a una autorradiografía, gracias al marcaje radiactivo de las moléculas. El resultado que se obtiene es una banda radiactiva para cada nucleótido, con lo que se puede ir leyendo la secuencia que tenía el fragmento inicial de ADN. La figura 3 muestra el proceso de secuenciación química.

Método químico de secuenciación de ácidos nucleicos mediante electroforesis.

Método enzimático. Es el método más utilizado en la actualidad. Requiere que el fragmento de ADN sea de hebra sencilla, por lo que es necesario someterlo a un proceso previo de desnaturalización. También son necesarios un pequeño cebador marcado radiactivamente, que puede ser específico y complementario a una secuencia concreta del ADN, y que servirá de enganche para el inicio de la síntesis de ADN; una polimerasa, que replicará el ADN; los cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP); y nucleótidos llamados didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP), nucleótidos modificados en los que se ha eliminado el oxígeno en la posición 3’ del azúcar (v. figura 3), pudiéndose incorporar a una cadena de ADN que se está sintetizando, pero provocando la parada de la síntesis porque a ellos no se les puede añadir ningún otro nucleótido.

Método enzimático de secuenciación de ácidos nucleicos utilizando la técnica didesoxi.

Se establecen cuatro tipos de reacciones diferentes ya que en cada tubo se añade el ADN, el cebador, la polimerasa y los nucleótidos, pero un nucleótido didesoxi diferente (en un primer tubo ddATP, en un segundo tubo ddTTP, etc.). En cada tubo comienza la síntesis de una cadena nueva a partir de los fragmentos de ADN introducidos, que son los que se quiere secuenciar. La ADN polimerasa irá añadiendo nucleótidos a la cadena en síntesis, hasta que incorpora un nucleótido didesoxi y la replicación se pare. El resultado que se obtiene es que en cada uno de los cuatro tubos se tiene una colección de fragmentos de diferentes tamaños, ya que la síntesis de las nuevas cadenas se paraliza en diferentes momentos. Al igual que en la secuenciación de tipo químico, estos fragmentos se separan por una electroforesis en gel, revelándolos mediante una autorradiografía, en la que se puede ir leyendo la secuencia del fragmento de ADN deseado. En la figura 4 se muestra este método de secuenciación.

Genomas secuenciados

En la actualidad, son muy numerosos los genomas de diferentes organismos que ya han sido completamente secuenciados. Gracias a estos experimentos se ha podido llegar a la conclusión de que la cantidad de genes de un genoma o el tamaño total de éste no se encuentra relacionado con la complejidad del organismo, sino que influyen otros tipos de factores. Entre los organismos secuenciados hay diferentes especies de bacterias, virus, parásitos, levaduras y hongos, animales y plantas.

Bacterias. Entre el grupo de las bacterias cabe destacar la secuenciación de las que son responsables de infecciones como el ántrax (carbunco) o la tos ferina. La secuenciación de la primera de ellas experimentó un gran impulso tras la continua amenaza de atentados con armas biológicas desatada después del 11-S. Los experimentos realizados han descubierto que el genoma de esta bacteria es muy similar al de microorganismos comunes como los que pueden provocar, por ejemplo, simples diarreas leves. Sin embargo, las pequeñas diferencias que existen entre un genoma y otro son las responsables de la letalidad del carbunco.

El estudio del genoma de la bacteria que provoca la tos ferina, Bordetella pertussis, por su parte, ha revelado la secuencia de nucleótidos de los 3.800 genes que posee, lo que permitirá la obtención de vacunas y tratamientos eficaces que provocará un descenso notable en la mortalidad que esta enfermedad provoca cada año (de 200.000 a 400.000 muertes anuales).

Virus. Entre los virus destaca la completa secuenciación del responsable de la neumonía atípica, que permitirá el desarrollo de tratamientos preventivos o de pruebas de diagnóstico más eficaces. En la actualidad, existe un acuerdo entre científicos de varios países para la secuenciación de los virus responsables de la gripe, enfermedad que provoca miles de muertes al año en todo el mundo. La complejidad del proyecto radica en la facilidad de este virus para mutar y dar lugar a multitud de variantes causantes de la enfermedad, por lo que el estudio implica la secuenciación de un gran número de genes que presentan diferencias muy pequeñas.

Parásitos. Dentro de este grupo, destaca la secuenciación del parásito que causa la malaria, Plasmodium falciparum, epidemia responsable de millones de muertes al año en países subdesarrollados (especialmente en el África subsahariana). Este hecho supone un paso fundamental en la investigación de tratamientos contra la enfermedad, aunque aún pasarán algunos años hasta llegar a este punto, ya que se necesita averiguar qué funciones desempeñan los casi 5.000 genes descubiertos.

Levaduras y hongos. La levadura Saccharomyces cerevisiae (levadura de la cerveza) fue el primer organismo eucariota en ser completamente secuenciado, hecho de gran relevancia, ya que esta levadura se utiliza como sistema experimental en multitud de investigaciones. Además, se ha demostrado que más de la mitad de las proteínas humanas que presentan mutaciones, causando enfermedades genéticas, poseen homologías de secuencia con proteínas de esta levadura, lo que supone una herramienta de gran utilidad para el estudio de estas enfermedades. Por otro lado, se piensa que Saccharomyces presenta grandes similitudes con otros tipos de levaduras de aplicación industrial y biomédico, por lo que el avance en la secuenciación de estas levaduras será muy rápido.

Animales. Entre los numerosos animales cuyo genoma ha sido secuenciado destacan los ratones, las ratas, los chimpancés, el gato, el conejillo de Indias y el conejo. Todos ellos han sido utilizados habitualmente como sistemas experimentales para la investigación de enfermedades humanas. Gracias al conocimiento de sus genomas, ahora es posible una experimentación mucho más completa, además de poder establecer los mecanismos de evolución de dichos animales.

Plantas. Dentro de este grupo destaca la secuenciación de los genomas de la planta del arroz, Oryza sativa, o de la malahierba Arabidopsis thaliana, sistema experimental muy utilizado en ingeniería genética.

Proyecto Genoma Humano

La idea de secuenciar el genoma de la especie humana se materializó con el inicio de las experimentaciones en Estados Unidos, en 1990. La investigación se ha llevado por dos vías paralelas: por un lado, se formó un consorcio público en el que participaban científicos pertenecientes a seis países diferentes (EE.UU., Reino Unido, Francia, Alemania, Japón y China); por otro lado, una empresa privada estadounidense, Celera Genomics, llevaba a cabo el mismo proyecto. Durante el tiempo que ha durado la investigación, la presencia de rivalidades entre ambos estudios ha sido constante, acusándose mutuamente de falta de rigor a la hora de interpretar los resultados. Con todo esto, un acuerdo de última hora permitió, en 2000, la presentación conjunta del primer borrador del genoma humano, en el que se descifraba el 97% de su secuencia. La totalidad de la secuencia (el 99,99 %) se consiguió presentar en 2003, gracias a las últimas experimentaciones realizadas por el consorcio público. De esta manera, ahora se sabe que el genoma humano está compuesto sólo por 30.000 genes, una tercera parte de lo que se había estimado en un principio, y tan sólo el doble que la mosca del vinagre o un tercio más que una lombriz intestinal, organismos mucho menos complejos.

Los chimpancés han sido objeto de estudio genético dada su aparente similitud con el ser humano. Otros animales como los ratones también sirven de «animales de referencia» para realizar investigaciones genéticas extrapolables al hombre.

La secuenciación del genoma ha descubierto ciertos hechos curiosos: que el ser humano comparte un 98% de su genoma con el genoma del chimpancé; que existe una mayor proximidad genética entre el hombre y las ratas que entre éstas y los ratones; o que el genoma humano es cinco veces más pequeño que el de una cebolla o 50 veces menor que el de un helecho. La secuenciación no sólo ha permitido la averiguación del orden de los nucleótidos, el denominado mapa físico, sino que también se ha podido establecer el orden de los genes que forman parte del genoma, el llamado mapa génico.

El establecimiento del mapa genético del hombre supone una auténtica revolución para el tratamiento y curación de ciertas enfermedades de origen genético hasta ahora incurables o hereditarias, como el cáncer, la diabetes, las enfermedades neurodegenerativas o la obesidad. Ello ha cambiado la manera de establecer los tratamientos, ya que se tratarán los genes defectuosos y no los síntomas, como se viene haciendo hasta ahora, y las medicinas estarán ajustadas, de manera específica, a cada paciente. Se ha dado un paso de gigante en el desarrollo de estas nuevas metodologías, pero de momento, habrá que esperar unos cuantos años para que se hagan realidad.

A pesar del futuro prometedor, la secuenciación completa del genoma humano también presenta su lado polémico, ya que hay muchas voces que indican que con este descubrimiento se abren las puertas, por ejemplo, a la clonación de humanos, o a que los individuos no puedan encontrar un trabajo o contratar un seguro si se conocen sus puntos débiles o su propensión a padecer ciertas enfermedades.